Giới thiệu

Chương trình nghị sự về ca cao toàn cầu kêu gọi một chiến lược tạo tri thức nhằm kết hợp năng suất, đổi mới công nghệ và tính bền vững trong chuỗi giá trị ca cao. Sản lượng ca cao ( Theobroma cacao L.) trên thế giới đạt năm triệu tấn vào năm 2012 (Ortiz-Rodrigues và cộng sự, 2015). Hiện tại, Colombia là nhà sản xuất ca cao thứ 4 ở Mỹ Latinh, sau Brazil, Ecuador và Cộng hòa Dominica. Năm 2012, diện tích canh tác cacao ở Colombia là khoảng 158.000 ha, với năng suất 460 kg ha-1, chắc chắn là thấp so với Bờ Biển Ngà, nước sản xuất đầu tiên trên toàn thế giới, với 700 kg ha-1 (Ortiz và cộng sự, 2014;Martínez-Ángel và cộng sự, 2015).

Sản xuất ca cao bị ảnh hưởng đáng kể bởi các bệnh nấm do hoạt động lên men vỏ quả không chỉ được ưa chuộng bởi các điều kiện độ ẩm và pH cụ thể, mà còn bởi tác dụng phản hồi tích cực của các axit hữu cơ mà nó tạo ra. Hơn nữa, vấn đề chính liên quan đến sự hiện diện của nấm sợi trong ca cao là nguy cơ sản sinh độc tố nấm mốc, có khả năng ảnh hưởng đến sức khỏe người tiêu dùng (Copetti và cộng sự, 2014). Sô cô la đã được báo cáo đóng góp với khoảng 6% tổng số tiếp xúc trong chế độ ăn uống với ochratoxin A, nhưng mức độ độc tố nấm mốc trong ca cao và sô cô la thường rất thấp. Tuy nhiên, vì các phương pháp phát hiện của nó rất tốn kém và đòi hỏi nhiều lao động,Codex Alimentarius Commission (2013) đã khuyến nghị giữ cho các đồn điền ca cao càng không bị nhiễm nấm mốc càng tốt.

Các cơ chế kiểm soát thông thường liên quan đến thực hành canh tác tốt, đôi khi kết hợp với việc sử dụng thuốc diệt nấm. Phương pháp đầu tiên dễ áp ​​dụng, nhưng bên cạnh việc đòi hỏi nhiều lao động, tính khả thi về kinh tế của nó phụ thuộc vào các giải thưởng thị trường ca cao được nâng cao (Hanada và cộng sự, 2009). Mặc dù thuốc diệt nấm bảo vệ thực vật khỏi sự tấn công của mầm bệnh, nhưng chúng có thể có những tác động có hại đối với ruồi Forcipomyia sp., Loài thụ phấn cho hoa ca cao (FAO, 2012). Kiểm soát sinh học hiện đang được sử dụng như một công cụ kiểm soát phytopathogens thân thiện với môi trường và dễ áp ​​dụng (Cuervo-Parra và cộng sự, 2011). Tuy nhiên, nó gây ra một số khó khăn nhất định, chẳng hạn như độ đặc hiệu cao giữa các chất kiểm soát sinh học và mầm bệnh (Krauss và cộng sự, 2013), sự cần thiết của bộ điều khiển để thích ứng với điều kiện đất đai và khí hậu của cây trồng, và thậm chí cả khả năng chống lại các tác nhân gây bệnh (Mbarga và cộng sự, 2014). Điều này đã làm cho nó trở nên cần thiết để khám phá các lựa chọn thay thế kiểm soát không theo quy ước.

Công nghệ nano là một công cụ quan trọng trong nông nghiệp hiện đại, đến mức công nghệ nano thực phẩm nông nghiệp theo định hướng sản xuất bền vững thực phẩm cho người và động vật có khả năng trở thành một trong những lĩnh vực có lợi nhuận cao nhất trong lĩnh vực này trong tương lai tới, đặc biệt là ở các nước đang phát triển (Ranjan và cộng sự, 2014). Hạt nano bạc (AgNPs) là một trong những vật liệu nano thuốc trừ sâu được sử dụng thường xuyên nhất. Chúng đã nhận được sự chú ý đặc biệt vì độ bay hơi thấp, độ ổn định cao và hoạt động kháng khuẩn rộng rãi (Pulit và cộng sự, 2013). Những vật liệu này đã được sử dụng thành công để ức chế sự phát triển của nấm phytopathogenic trên cỏ và trên dưa chuột, lúa (Krishnaraj và cộng sự, 2012), và cây lấy gỗ (Nasrollahi và cộng sự, 2011).

Nỗ lực này được đóng khung trong việc khám phá rộng hơn các giải pháp thay thế mới để kiểm soát các phytopathogens cản trở tính bền vững của loại cây trồng này.

Mục tiêu của công việc này là đánh giá tác dụng diệt vi sinh vật của các hạt nano bạc (AgNPs) đối với các loại nấm độc có khả năng ảnh hưởng đến cây ca cao ( Theobroma cacao ).

Nguyên liệu và phương pháp tổng hợp nano bạc

Các hạt nano bạc Biopure-AgNP (NanoComposix, San Diego, CA, Hoa Kỳ) ở nồng độ ban đầu 1.000 ppm (1,8×1014 hạt mL-1), nồng độ mol nguyên tử 9,27 mmol L-1, hình thái cầu và đường kính 10 nm được sử dụng làm vật liệu ức chế. AgNP dạng keo này được pha loãng trong nước cất vô trùng ở nhiệt độ phòng (22 ° C), để thu được huyền phù ở nồng độ từ 50 đến 100 ppm. Tất cả huyền phù được bảo quản ở 4 ° C, trong bóng tối, cho đến khi thi công.

Hai mươi trái ca cao bị bệnh đã được chọn từ các trang trại ở các thành phố Chinácota và El Zulia, thuộc Bộ Norte de Santander, Colombia, ở độ cao từ 220 đến 1.200 m, nhiệt độ từ 22 đến 30 ° C và độ ẩm tương đối từ 63 đến 86%. Các trang trại được chọn từ danh sách các cộng sự của Liên đoàn Quốc gia những người trồng cacao của Norte de Santander. Các vật liệu sinh học khác nhau – dòng vô tính và cây lai – được lấy mẫu từ quả ca cao với các triệu chứng như: biến dạng; quầng vàng; và các vết màu sô cô la có đường viền rõ ràng hoặc bột màu kem (Phillips-Mora và cộng sự, 2007). Vỏ quả được bọc trong tấm nhựa, dán nhãn và vận chuyển trong hộp đến phòng thí nghiệm để thử nghiệm.

Nấm có khả năng gây độc tố được thu nhận từ vỏ ca cao. Bào tử chứa trong vỏ quả bên ngoài được mạ trực tiếp trên thạch khoai tây (PDA), được sửa đổi bằng chiết xuất vỏ quả ca cao và chloramphenicol (PDA-CC). Các mẫu cấy tinh khiết thu được từ các mẫu không đồng nhất, được đặc trưng về mặt hình thái và phân tử.

Đặc điểm hình thái học theo một phương pháp luận được sửa đổi từAb Majid và cộng sự. (2015). Cấu trúc sinh sản (bào tử), loại sợi nấm và sự hiện diện của vách ngăn được quan sát bằng phương pháp nhuộm màu xanh lam lactophenol. Kỷ lục ảnh thu được bằng kính hiển vi quang học tương phản pha Eclipse 80i (Nikon, Nhật Bản).

DNA được phân lập bằng cách sử dụng kit phân lập DNA vi sinh vật ultraclean (Phòng thí nghiệm Mo Bio, Carlsbad, CA, Hoa Kỳ) và được chuẩn bị theo thông số kỹ thuật của nhà sản xuất. DNA phân lập được khuếch đại bằng cách sử dụng hai chỉ thị phân tử, tương ứng với vùng ITS và gen β-tubulin (Ab Majid và cộng sự, 2015) (Bảng 1 ). Sau đó, DNA khuếch đại được giải trình tự bởi Macrogen (Seoul, Hàn Quốc) và phân tích bằng cơ sở dữ liệu Blast.

Nano bạc trị nấm Aspergillus flavus và Fusarium solani trên cây ca cao -

Các thử nghiệm ức chế AgNP được thực hiện trong các môi trường khác nhau: môi trường tổng hợp lỏng và rắn, và bột giấy và vỏ ca cao. Thử nghiệm đầu tiên được thực hiện trên canh trường chiết xuất mạch nha được cải tiến bằng AgNPs ở 80, 85, 90, 95 và 100 ppm. Các đĩa vi pha loãng huyết thanh (Sterile, Corning Costar Corporation, New York, NY, USA) được cấy với 200 µL môi trường đã sửa đổi và 100 µL mỗi loại nấm phân lập (107 conidia mL-1). Năm lần lặp lại của mỗi thử nghiệm đã được thực hiện (CLSI, 2012).

Thử nghiệm thứ hai được thực hiện trên đĩa Petri (60×15 mm) có chứa PDA-CC được biến đổi bằng AgNPs ở 50, 70, 90 và 100 ppm. Mỗi đĩa Petri được cấy với các nút thạch đường kính 6 mm, mỗi đĩa chứa một môi trường nuôi cấy non của các phytopathogens đã được phân lập. Sự phát triển xuyên tâm của sợi nấm được nuôi cấy ở 25 ° C trong PDA-CC được đo trong khoảng thời gian 18 ngày. Đĩa Petri không có AgNP và được cấy mầm bệnh được sử dụng làm đối chứng tích cực, tuân theo phương pháp luận được điều chỉnh từNasrollahi và cộng sự. (2011). Tất cả các thử nghiệm được lặp lại ba lần.

Thử nghiệm cuối cùng được thực hiện trực tiếp trên cùi và vỏ ca cao. Tấm TC vô trùng, 24 giếng, có nắp (Cellstar, Sigma Aldrich, St. Louis, MO, Hoa Kỳ) được sử dụng để đặt các miếng vỏ và cùi ca cao 0,5×0,5 cm, trước đây đã được khử trùng trong xử lý nhiệt ẩm (121 ° C, áp suất 15 lb, và 20 phút) và được tăng sinh nhân tạo với 100 µL của 107 ml-1 huyền phù bào tử conidia. Các đĩa được ủ ở 25 ° C trong 18 ngày. Ba giếng có chứa bã ca cao và vỏ não bị nhiễm các phytopathogens tương ứng được sử dụng làm đối chứng tích cực, như được điều chỉnh từNasrollahi và cộng sự. (2011). Phần cùi và vỏ ca cao không bị nhiễm khuẩn được sử dụng làm đối chứng âm tính. Hiệu quả ức chế được xác định theo phương pháp vĩ mô là độ pha loãng AgNP thấp nhất mà tại đó không có phytopathogens nào được thử nghiệm được quan sát thấy phát triển sau thời gian ủ bệnh 18 ngày (Monteiro và cộng sự, 2011). Các thay đổi cấu trúc của nấm sau khi xử lý với 50 ppm AgNP được theo dõi bằng kính hiển vi điện tử quét (SEM 08 30 SEI, Korea).

Kết quả và thảo luận về hiệu quả nano bạc

Có khả năng gener cotoxigenic của tôi như Aspergillus và Fusarium là một trong những mầm bệnh được tìm thấy nhiều nhất trong các quả bị bệnh đã được nghiên cứu.Mounjouenpou và cộng sự. (2008) đã phân tích sự phát triển của nấm độc tố trong cây ca cao, ở Cameroon, và xác định cùng một chi, bao gồm A. carbonarius và A. niger , là những loài có khả năng tạo ra ochratoxin A. Các đặc điểm vĩ mô và vi mô của các phytopathogens trùng với báo cáo trước đó quaSuárez Contreras & Rangel Riaño (2013) được hiển thị trong Hình 1 .

Nano bạc trị nấm Aspergillus flavus và Fusarium solani trên cây ca cao -

Việc xác định đặc tính phân tử cho phép xác định các chủng Aspergillus flavus và Fusarium solani phân lập được . Hai loài này là mầm bệnh thứ cấp gây nhiễm trùng và suy thoái quả hoàn toàn có cơ hội, bằng cách lợi dụng sự hư hỏng của vỏ ca cao do các mầm bệnh chính có hoạt tính enzym mạnh gây ra (Cuervo-Parra và cộng sự, 2011). Tuy nhiên, sự hiện diện của những loại nấm này rất có ý nghĩa đối với sức khỏe cộng đồng vì khả năng gây độc tố của chúng (Villamizar và cộng sự, 2011).Copetti và cộng sự. (2014) báo cáo rằng việc cô lập thường xuyên các loài nấm có khả năng gây độc trong ca cao là một nguyên nhân đáng lo ngại vì chúng có thể tạo ra aflatoxin và ochratoxin loại A – cả hai chất chuyển hóa đều có tác dụng gây ung thư – và đã được tìm thấy trong hạt ca cao và trong sô cô la được sản xuất và chế biến.

Các thử nghiệm ức chế bằng cách sử dụng AgNPs trong môi trường lỏng cho thấy F. solani và A. flavus phát triển ở tất cả các nồng độ được thử nghiệm, sau đó chứng tỏ khả năng chống lại tác động của AgNPs cao nhất (Bảng 2 ). Tác dụng ức chế của AgNP đối với các phytopathogens này cũng đã được thử nghiệm trong thử nghiệm đĩa Petri với môi trường rắn (PDA-CC) (Hình 2 ), bao gồm một phạm vi nồng độ AgNP rộng hơn (50 đến 100 ppm).

Nano bạc trị nấm Aspergillus flavus và Fusarium solani trên cây ca cao -

Nano bạc trị nấm Aspergillus flavus và Fusarium solani trên cây ca cao -

Các đặc tính kháng khuẩn của AgNP phụ thuộc vào một số khía cạnh, chẳng hạn như hình thái, kích thước và nồng độ. Về nguyên tắc, các hạt nano hình cầu có đường kính dưới 10 nm được sử dụng trong thử nghiệm này có thể tạo điều kiện tương tác với mục tiêu bằng các hiệu ứng điện tử ở cấp độ tế bào (Kim và cộng sự, 2007). Tuy nhiên, chỉ những thay đổi về kết cấu và sắc tố mới được gây ra trong các phytopathogens được thử nghiệm.

Sự phát triển của sợi nấm, được đo trên đĩa Petri, cho phép định lượng ảnh hưởng của AgNPs lên các phytopathogens.Hình 3 cho thấy hành vi của hai loại nấm được nghiên cứu khi được xử lý có hoặc không có AgNPs. Tác dụng ức chế là 5,32 và 3,29% đối với F. solani và A. flavus , tương ứng. Do đó, không có thay đổi đáng kể nào có thể được quy cho AgNPs.

Nano bạc trị nấm Aspergillus flavus và Fusarium solani trên cây ca cao -

Khả năng kháng của nấm đối với các hạt nano bạc là do chúng có khả năng tạo ra các chất chuyển hóa thứ cấp (Pulit và cộng sự, 2013). Các chất chuyển hóa thứ cấp chính được tạo ra bởi chi Aspergillu s bao gồm polyketides (PK), peptide ribosome và không phải ribosome (NRPs), và terpenoids (Andersen và cộng sự, 2013). Tuy nhiên, khía cạnh cụ thể này cần được nghiên cứu chi tiết hơn. Một cách giải thích khác là dựa trên khả năng của một số chủng F. solani và A. flavus để tiến hành tổng hợp ngoại bào các hạt nano bạc. Điều này ngụ ý sự hiện diện của các enzym khử ion bạc và do đó, một số khả năng chống lại kim loại này (Alghuthaymi và cộng sự, 2015).

Các thử nghiệm được thực hiện trực tiếp trên các mô quả ca cao (cùi và vỏ) cho thấy A. flavus phát triển nhẹ trên vỏ. Vì vậy, mặc dù một tác dụng ức chế được quan sát thấy ở 50 ppm, nhưng nồng độ AgNP tối thiểu là 80 ppm là cần thiết để ức chế hoàn toàn sự phát triển của nấm. Điều này có thể là do thành phần vỏ não, có tác dụng cản trở sự xâm nhập của nấm. Ngược lại, nấm có thể phát triển ở mọi nồng độ trong thịt quả. Điều này có thể được giải thích bởi khả năng thủy phân mô này của một số loài, do đó tạo ra axit tạo điều kiện cho nấm phát triển thông qua việc giảm độ pH (Copetti và cộng sự, 2014). Trong mô này, ngay cả nồng độ cao nhất (90-100 ppm) cũng không thể ảnh hưởng đáng kể đến sự phát triển của nấm.

Fusarium solani được quan sát là có khả năng chống lại AgNPs cao hơn (Hình 4 ).Kasprowicz và cộng sự. (2010) báo cáo rằng môi trường PDA nghèo dinh dưỡng được biến đổi với các hạt nano bạc làm tăng sản xuất bào tử. Hiện tượng này có thể là do F. solani tạo ra đa bào tử cung, bằng cách biểu hiện tổ chức đa bào phức tạp (Harris, 2005), có thể cản trở sự vận chuyển bên trong của các hạt nano bạc, do đó làm giảm tác dụng diệt nấm của chúng.

Nano bạc trị nấm Aspergillus flavus và Fusarium solani trên cây ca cao -

Tác dụng kháng khuẩn của các hạt nano liên quan đến nồng độ được sử dụng và tốc độ chúng được giải phóng. Trong nghiên cứu hiện tại, tác động này trên môi trường nuôi cấy khác với tác động được quan sát thấy trong các mô quả (vỏ và cùi). Điều này có thể được giải thích là do môi trường nuôi cấy tổng hợp chứa tất cả các chất dinh dưỡng cần thiết cho sự phát triển của nấm, trong khi các mô thực vật – đặc biệt là vỏ – cung cấp một rào cản tự nhiên để xâm nhập vào vỏ quả. Do đó, các hạt nano bạc có nhiều khả năng ảnh hưởng đến sự sinh sản tự nhiên của nấm. Điều này phù hợp với những phát hiện trước đây được báo cáo bởiLamsal và cộng sự. (2011), người đã báo cáo sự ức chế sinh trưởng của Colletotrichum sp., tác nhân gây bệnh thán thư trên cây tiêu, bằng AgNP ở 100 ppm trong nuôi cấy PDA; trong khi nồng độ dưới 50 ppm là đủ để thu được kết quả tương tự như trên thực địa.

Trong khi bạc kim loại là trơ, AgNPs có phản ứng cao do tạo ra các ion Ag + (Morones và cộng sự, 2005). Ở nấm, các hạt nano bạc có thể gây ra những thay đổi cấu trúc trong sợi nấm, biến dạng thành tế bào, tổn thương màng, và những thay đổi đáng kể ở dạng bào tử và sự nảy mầm, tùy thuộc vào nồng độ thuốc diệt nấm (Lamsal và cộng sự, 2011). Trong nghiên cứu này, nghiệm thức 50 ppm gây ra những thay đổi nhỏ trong cấu trúc sợi nấm, đặc trưng bởi sự biến dạng sợi nấm ở F. solani , và bằng cách thu nhỏ cấu trúc sinh sản, chẳng hạn như conidia, ở A. flavus (Hình 5 ). Tuy nhiên, những thay đổi hình thái này không ảnh hưởng đến vòng đời của nấm được nghiên cứu.

Nano bạc trị nấm Aspergillus flavus và Fusarium solani trên cây ca cao -

Các quan điểm nghiên cứu trong tương lai bao gồm khám phá việc sử dụng các hạt nano bạc được tổng hợp bằng công nghệ sinh học hoặc vật liệu nano hữu cơ, mà các phối tử sinh học bề ngoài của chúng có thể tăng cường tác dụng diệt nấm của chúng.

Nguồn tham khảo: Fungicidal effect of silver nanoparticles on toxigenic fungi in cocoa Raquel Villamizar-GallardoJohann Faccelo Osma CruzOscar Orlando Ortíz-Rodriguez

NANO NNA VIỆT NAM