Giới thiệu

Các hạt nano oxit kẽm (ZnO NP) đã được chứng minh là có khả năng kiểm soát hiệu quả sự phát triển của vi sinh vật [ 1 ]. Chúng rẻ hơn các hạt nano bạc với hiệu suất quang xúc tác rất cao [ 2 ] và tương hợp sinh học hơn so với các vật liệu xúc tác quang vô cơ khác như titanium dioxide [ 3 ]. Do đó, chúng được sử dụng phổ biến như một chất chống vi khuẩn tích cực trong bao bì thực phẩm [ 4 ], trong ngành dệt may [ 5 ], sơn [ 6 ] và chất dẻo [ 7 ].

Trong những thập kỷ gần đây, của các hạt nano đã được quan tâm rộng rãi vì nó thân thiện với môi trường, đáng tin cậy, tiết kiệm chi phí và không đòi hỏi áp suất cao hoặc năng lượng cao [ 8 ]. Về cơ bản, quá trình các hạt nano có thể đạt được bằng cách bổ sung các chất khử và / hoặc các chất đóng vai trò kim loại như flavonoid, phenol, enzym và aldehyde [ 9 , 10 ] có trong thực vật hoặc vi sinh vật, kể cả động vật [ 11 ]. Một số nghiên cứu đã báo cáo tổng hợp thành công các NP ZnO có hoạt tính kháng khuẩn từ các nguồn sinh học khác nhau, ví dụ, thực vật [ 12 – 14 ], vi sinh vật [ 15 ], tảo [ 16], và các chất ủ sinh học như vỏ rau [ 17 ], vỏ quả cam [ 18 ], vỏ chuối [ 19 ], và vỏ sầu riêng [ 20 ]. Ngoài ra, quá trình sinh tổng hợp các NP ZnO cũng được tiến hành dựa trên hoạt tính kháng nấm của chúng. Ví dụ, các NPN ZnO hình cầu được tổng hợp bởi Aspergillus terreus đã được báo cáo là có khả năng ức chế mạnh đối với Aspergillus niger (gây bệnh mốc đen trên một số loại trái cây) , Aspergillus fumigatus (gây bệnh aspergillosis ở người) và Aspergillus aculeatus (tác nhân gây bệnh thực vật) [ 21 ]. Hơn nữa, các NP ZnO bằng cách sử dụng chiết xuất hoa của Nyctanthes arbortristischo thấy có hoạt tính kháng nấm hiệu quả đối với các loài nấm mốc Alternaria (gây bệnh đốm lá ở thực vật), Aspergillus niger , Botrytis cinerea (gây thối mốc xám), Fusarium oxysporum (tác nhân gây thối rữa ở thực vật), và Penicillium expansum (gây mốc xanh) [ 22 ]. Sau đó, các NP ZnO đã được chứng minh là chất kháng nấm có tiềm năng cao chống lại các loại nấm gây bệnh cho cây trồng.

Colletotrichum spp. là nguyên nhân phổ biến nhất của bệnh sau thu hoạch được gọi là bệnh thán thư. Nó lây nhiễm rộng rãi cho một số loại trái cây nhiệt đới [ 23 , 24 ], nhiều loại cây và rau [ 25 ] bao gồm cả một loại cây cảnh như hoa lan [ 26 , 27 ]. Nhiễm khuẩn Colletotrichum sp. trên các loài lan như C. gloeosporioides [ 28 ] hoặc C. boninense [ 29 ] gây ra các đốm lá tròn lõm được gọi là bệnh thán thư hoặc các vết hoại tử dẫn đến rụng lá và chết cây trong những trường hợp nặng. Do đó, bệnh thán thư do nấm Colletotrichum gây raspp. đã gây ra những tổn thất nghiêm trọng trong sản xuất [ 28 , 30 ]. Mặc dù bệnh thán thư chủ yếu được kiểm soát dựa trên việc điều trị bằng thuốc diệt nấm, Colletotrichum spp. đã được báo cáo là có khả năng phát triển khả năng kháng thuốc trừ nấm ở một số loại cây trồng [ 31 – 33 ]. Do đó, điều quan trọng là phải tìm ra các biện pháp quản lý thay thế để kiểm soát sự xâm nhiễm của các loại nấm gây bệnh thực vật như Colletotrichum sp.

Do đó, nghiên cứu này nhằm mục đích tổng hợp các NP ZnO bằng phương pháp hóa học sử dụng chiết xuất thô từ vỏ chuối ( Musa sapientum ) trong một quy trình tổng hợp quy mô lớn. Các tính chất vật lý của các NP ZnO tổng hợp sau đó được đặc trưng cho cấu trúc, hình thái và phổ hấp thụ của chúng bằng cách sử dụng nhiễu xạ tia X (XRD), kính hiển vi điện tử quét (SEM) và máy quang phổ nhìn thấy tia UV, tương ứng. Hơn nữa, hóa học bề mặt của các hạt nano cũng được phân tích bằng máy quang phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FTIR). Hơn nữa, hoạt tính chống nấm của các NP ZnO tổng hợp chống lại Colletotrichum spp. Dendrobium sp đã bị nhiễm bệnh . (Sonia Earsakul) [ 34 ] cũng được xác định trong cả thử nghiệm trong ống nghiệm và thử nghiệm trong nhà kính.

Vật liệu và phương pháp

1. Chuẩn bị chiết xuất thô từ vỏ chuối

Vỏ chuối chín vừa ( Musa sapientum ) đã được chuẩn bị như mô tả trước đây trong Ruangtong et al. [ 19 ]. Trong nghiên cứu này, 400% (w / v) chiết xuất thô được chuẩn bị bằng cách chiết 3.200 mg vỏ chuối nghiền trong 800 mL nước cất ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ dưới sự khuấy liên tục (VELP Scientifica). Tiếp theo, dịch chiết thô được lọc hai lần bằng vải lọc và sau đó được bảo quản ở 4 ° C cho đến khi sử dụng tiếp.

2. Tổng hợp quy mô lớn các NP ZnO bằng phương pháp hóa học sử dụng chiết xuất vỏ chuối

Đầu tiên, 800 mL dung dịch kẽm axetat 2 M (Ajax Finechem) được chuẩn bị bằng cách sử dụng nước khử ion. Sau đó, nó được trộn với 800 mL 400% (w / v) chiết xuất thô vỏ chuối ở 30 ° C trong điều kiện khuấy liên tục bằng máy khuấy từ (VELP Scientifica). Sau 1 h, hỗn hợp được điều chỉnh đến pH 12 bằng dung dịch NaOH 10M. Tiếp theo, các chất kết tủa được lọc bằng giấy lọc Whatman, loại 4 (GE Healthcare), sau đó được làm khô trong lò nóng (Kelvitron®) ở 80 ° C qua đêm. Cuối cùng, bột trắng được thu thập, rửa nhiều lần bằng nước cất, và tiếp tục nung trong lò nóng ở 80 ° C cho đến khi khô. Quá trình tổng hợp này được thực hiện độc lập ba lần. Đối với mỗi lần tổng hợp, khối lượng bột thu được được đo hai lần bằng cách sử dụng cân phân tích bốn chữ số (Thomas Scientific).

3. Máy đo nhiễu xạ tia X (XRD)

Các mẫu nhiễu xạ tia X được ghi lại bằng máy đo nhiễu xạ tia X (Bruker d8 Advance) sử dụng bức xạ Cu K của độ dài bước sóng = 0.1541 nm trong phạm vi quét 2 = 20-80^oC. Sau đó, tìm kiếm pha được so sánh bằng cách sử dụng ZnO wurtzite JCPDS số 00036-1451 [ 35 ].

4. Quang phổ UV-VIS

Phổ hấp thụ quang của ZnO tổng hợp phân tán trong nước (khoảng 500  μ g / mL) được ghi lại bằng máy quang phổ UV-VIS (SHIMADZU). Các phổ đo nằm trong khoảng từ 300 đến 600 nm. Tiếp theo, độ rộng vùng cấm quang học của ZnO được xác định bằng biểu đồ Tauc [ 36 ].

5. Kính hiển vi điện tử quét (SEM)

Trước khi phân tích, các hạt ZnO được gắn trên các gốc nhôm và được phủ một lớp màng vàng. Hình thái của ZnO được thực hiện bằng cách sử dụng SEM (FEI). Kích thước của các hạt sau đó được phân tích bằng chương trình ImageJ [ 37 ].

6. Phân tích quang phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FTIR)

Vỏ chuối đã tiếp đất và các NP ZnO tổng hợp được phân tích bằng cách sử dụng Vertex 70, Platinum ATR (Bruker) bằng cách thu thập phổ ở nhiệt độ phòng dưới áp suất khí quyển, ở mức trung bình 32 lần quét với độ phân giải 4 cm ^-1 . Chế độ ATR được thực hiện từ 200 đến 4.000 cm ^-1 . Bảng phổ IR (Merck) sau đó được sử dụng để xác định các nhóm chức và lớp hợp chất.

7. Cách ly nấm

Cây lan có triệu chứng, Dendrobium sp. (Sonia Earsakul), được thu thập vào tháng 6 năm 2020 để xác định tác nhân gây bệnh. Việc phân lập nấm từ lá phong lan được thực hiện theo kỹ thuật cấy mô được mô tả trong Agrios (2005) [ 38 ]. Cụ thể, những chiếc lá bị nhiễm bệnh đã được cắt thành 0.5 cm *0.5 cm, được làm sạch kỹ lưỡng và ngâm trong dung dịch chứa 10% NaOCl (Công ty Clorox®, Giang Tô Trung Quốc) trong 3 phút. Lá được tráng bằng nước cất vô trùng (SDW) hai lần và làm khô trên giấy lọc vô trùng. Tiếp theo, lá được đặt trên thạch dextrose khoai tây (PDA; Difco Oxford, Vương quốc Anh) và ủ ở 25 ± 02^oC cho đến khi sợi nấm được phát triển trên các lá bị nhiễm bệnh. Sau đó, sợi nấm được nuôi cấy sang PDA tươi để thu được các mẫu cấy tinh khiết để xác định.

8. Nhận dạng và Đặc điểm của Colletotrichum sp.

Ba chủng nấm Colletotrichum sp. bao gồm KUFC 021, KUFC 022, và KUFC 023 đã được thu được, các mẫu cấy được nuôi cấy trên PDA trong 7 ngày ở 25 ± 2 ° C. Các đặc điểm vĩ mô của nấm đã được quan sát, chẳng hạn như màu sắc khuẩn lạc, tốc độ phát triển, sản xuất sắc tố nấm và quả thể. Các đặc điểm vi mô như acervuli và các đặc điểm của loài đồng bào được kiểm tra dưới phương pháp soi nổi ( Olympus, Tokyo, Nhật Bản) và hợp chất ( Carl Zeiss, Jena, Đức) và so sánh với các đặc điểm trong khóa nhận dạng và mô tả loài [ 39 ].

9. Kiểm tra khả năng gây bệnh

Dựa trên sự hình thành bào tử, Colletotrichum sp. phân lập KUFC 021 đã được chọn để thử nghiệm gây bệnh trên ba cây dendrobium năm tháng tuổi trong nhà kính. Năm lá bị thương bằng kim tiêm được cấy bằng cách phun hỗn dịch bào tử 10 ⁶ conidia / mL được chuẩn bị từ mẫu phân lập. Các cây được cấy bằng SDW đóng vai trò là đối chứng. Các cây cấy đã được ủ trong một buồng ẩm ở 25 ± 02^oC trong 48 giờ và sau đó được duy trì trong 7 ngày trong nhà kính để đánh giá triệu chứng [ 26 ].

10. Thử nghiệm hoạt tính kháng nấm trong ống nghiệm của các NP ZnO

Trong hoạt động chống nấm của các NP ZnO để kiểm soát Colletotrichum sp., Phân lập KUFC 021 đã được thử nghiệm in vitro ba lần trên PDA. Các đĩa sợi nấm (đường kính 5 mm được loại bỏ khỏi rìa của mẫu cấy 7 ngày tuổi) được chuyển sang PDA đã được sửa đổi với các NP ZnO ở sáu nồng độ khác nhau (5.000, 7.500, 12.500, 15.000, 17.500 và 20.000 mg / L). Thí nghiệm được tiến hành bằng cách bao gồm đĩa thạch đối chứng âm tính (không có ZnO NP) và hai đĩa đối chứng dương tính, đó là đĩa PDA có chứa thuốc diệt nấm tiếp xúc (mancozeb 80% W / W WP, Corteva Ltd., Thái Lan) và thuốc diệt nấm toàn thân (carbendazim 50% W / W WP, Erawan Ltd., Thái Lan). Năm đĩa PDA lặp lại cho mỗi lần xử lý được ủ ở. Hoạt động kháng khuẩn được đánh giá bằng cách đo đường kính khuẩn lạc ở thời điểm 7 và 14 ngày sau khi ủ. Phần trăm ức chế sự phát triển của sợi nấm được tính như (A-B/A)*100, trong đó A và B là đường kính của khuẩn lạc nấm được nuôi trong đĩa đối chứng âm và đường kính của khuẩn lạc nấm được nuôi trong đĩa có chứa các NP ZnO tổng hợp, tương ứng. Sau đó, các giá trị EC ₅₀ của ZnO NP đối với Colletotrichum sp. (KUFC 021) được tính toán bằng GraphPad QuickCalcs (phần mềm GraphPad).

11. Đánh giá hoạt động chống nấm trong nhà kính từ các NPN ZnO

Hiệu quả của các NPN tổng hợp ZnO đã được đánh giá trong việc kiểm soát bệnh thán thư trên lan in vivo . Một trăm hai mươi cây Dendrobium sp. (Sonia Earsakul) được trồng trong nhà kính và sắp xếp theo thiết kế hoàn toàn ngẫu nhiên (CRD) cho sáu nghiệm thức (đối chứng tích cực, đối chứng tiêu cực, 1 g / L carbendazim, 1.5 g / L mancozeb, 20 g / L NPs ZnO , và 30 g / L NPN ZnO) với 20 lần lặp lại mỗi lần xử lý. Năm nghiệm thức được phun hỗn dịch bào tử Colletotrichum sp. (KUFC 021) ở 10⁸ conidia/ml trong khi đối chứng âm bị phun nước. Sau đó cây được bao phủ bằng túi nhựa trong 24 giờ. Các túi nhựa được loại bỏ sau khi cấy, và hai nồng độ khác nhau của ZnO ở 20 và 30 g / L được áp dụng cho cây phong lan và so với 1 g / L carbendazim và 1,5 g / L mancozeb khi sử dụng thuốc xịt lá. Để kiểm soát tích cực, các cây đã được phun nước. Tỷ lệ phần trăm của chỉ số mức độ bệnh và mức độ bệnh [ 40] được tính vào thời điểm 7 và 14 ngày sau khi nộp đơn. Mức độ nghiêm trọng của bệnh được chấm theo thang điểm từ 1 đến 5, trong đó mức độ 1 cho thấy không bị nhiễm trùng, khỏe mạnh; cấp độ 2 biểu hiện nhiễm bệnh 1-10%, vùng lá có vết bệnh hoại tử; cấp 3 nhiễm 11-20%, diện tích lá có vết bệnh màu nâu đen với các đốm màu; cấp độ 4 cho thấy nhiễm từ 21-50%, và diện tích lá có vết bệnh / vết bệnh màu nâu đen liên kết lại với nhau tạo thành các vết to và cấp 5 cho thấy nhiễm trên 50%, lá bị nhiễm nặng chuyển sang màu nâu hoàn toàn và hình thành một số vòng đồng tâm.

12. Phân tích thống kê

Dữ liệu P được phân tích bằng phần mềm thống kê SPSS (phiên bản 22). Ảnh hưởng của các nồng độ khác nhau của ZnO NP tổng hợp lên sự phát triển của nấm được đánh giá bằng phân tích phương sai một chiều (ANOVA). Thử nghiệm nhiều phạm vi của Duncan được sử dụng để so sánh sự khác biệt giữa các phương pháp điều trị. giá trị nhỏ hơn 0,05 được coi là có ý nghĩa thống kê.

Kết quả

1. Đặc điểm vật lý của các nano kẽm oxit được tổng hợp từ chiết xuất vỏ chuối trong quá trình tổng hợp quy mô lớn

Nghiên cứu này được thiết kế để đơn giản hóa quá trình tổng hợp các nano kẽm oxit phương pháp sinh học mà không cần đến máy ly tâm hoặc lò vi sóng trong phòng thí nghiệm và nhằm mục đích thu được năng suất cao của các NP ZnO. Bằng cách tiến hành ba lần tổng hợp độc lập, trong mỗi lần tổng hợp thu được một loại bột màu trắng với lượng trung bình là 177.25 ±8.17g. Cả ba tổng hợp đều cung cấp độ kết tinh cao của ZnO và zincite (JCPDS số 00-036-1451) mà không có các tạp chất tinh thể khác như được chứng minh trong phổ XRD đại diện (Hình 1 (a) ). Hình ảnh SEM minh họa cho thấy hầu hết ZnO được tổng hợp có hình cầu và hình bầu dục ngắn với đường kính trung bình là 256 ± 40 nm (Hình 1 (b) ). Đặc tính quang học của các nano kẽm oxit tổng hợp sau đó được nghiên cứu bằng phương pháp quang phổ nhìn thấy được tia UV. Kết quả là, các NP ZnO phân tán trong nước khử ion cho thấy đỉnh hấp thụ có tâm ở ~ 370 nm (Hình 1 (c) ). Bằng cách sử dụng biểu đồ Tauc [ 36 ], giá trị độ rộng vùng cấm quang học được tính toán được tìm thấy là ~ 2,8 eV. Ngoài ra, phổ FTIR cho biết sự hiện diện của một số nhóm chức trên các NP ZnO (Hình 1 (d) ). Các đỉnh đặc trưng thu được từ 600 đến 450 cm ^-1 xác nhận các liên kết kéo dài của Zn-O, trong khi đỉnh ở 3427 cm ^-1thuộc đoạn OH của nhóm axit cacboxylic có trong cả NP ZnO và vỏ chuối. Hơn nữa, các đỉnh ở 1638 cm ^-1 , 1536 cm ^-1 và 1407 cm ^-1 của các NP ZnO tổng hợp tương ứng với sự kéo dài C = C, kéo dài NO và uốn OH tương ứng (Hình 1 (d) ).

Hình 1: Tính chất vật lý của các nano kẽm oxit từ vỏ chuối: (a) phân tích XRD, (b) ảnh SEM, (c) phổ UV-vis, và (d) phổ FT-IR.

 

2. Đặc điểm của Colletotrichum sp. Phân lập gây bệnh thán thư trên hoa lan

Ba chủng nấm phân lập bao gồm KUFC 021, KUFC 022 và KUFC 023 được thu nhận từ những lá bị nhiễm bệnh của Dendrobium sp. (Sonia Earsakul) với các triệu chứng bệnh thán thư như nhiều vết đen trên lá và đầu lá chuyển sang màu nâu (Hình 2 (a) ). Sau đó, cả đặc điểm văn hóa và hình thái đều được kiểm tra. Sau 7 ngày, màu sắc khuẩn lạc của các chủng phân lập là màu nâu sẫm với đường kính trung bình 8,5-9 cm (Hình 2 (b) ). Bào tử hình trụ được tạo ra bên trong các acervuli màu đen chứa đầy các khối bào tử màu cam (Hình 2 (c) ). Setae cũng được sản xuất và phát hiện có dạng hạt giống với màu nâu sẫm (Hình 2 (d)) trong khi appressoria có hình trứng đến hình dạng hơi bất thường và có màu nâu sẫm (Hình 2 (e) ). Bào tử có hình que và không màu, từ 12-17×3-6 µm về kích thước (Hình 2 (f) ). Tổng hợp tất cả lại với nhau, đặc điểm hình thái cho thấy rằng tất cả các chủng phân lập đều là Colletotrichum sp. Để xác nhận các loài Colletotrichum , cần phải xác định đặc tính phân tử cho một thí nghiệm trong tương lai.

Hình 2: Đặc điểm của một loại nấm cô lập, Colletotrichum sp. (KUFC 021) gây bệnh thán thư trên lan, Dendrobium sp. (Sonia Earsakul) (a) lá bị nhiễm với các triệu chứng thán thư, (b) khuẩn lạc trên đĩa PDA, (c) acervulus, (d) setae, (e) appresoria, (f) conidia. Thanh tỷ lệ cho d và f = 20 µM và e = 5µM

Ngoài ra, một thử nghiệm khả năng gây bệnh đã được thực hiện. Vết bệnh màu nâu sẫm phát triển ở rìa lá. Trên vết bệnh, các khối bào tử màu cá hồi hình thành đồng tâm, giống với các triệu chứng xảy ra trên đồng ruộng, được quan sát thấy trên lá từ 7 đến 10 ngày sau khi cấy, trong khi các triệu chứng này không xảy ra ở cây đối chứng (số liệu không được hiển thị). Loại nấm tương tự đã được làm lại từ các cây được cấy. Thử nghiệm khả năng gây bệnh cho thấy rằng các phân lập của Colletotrichum sp. (KUFC 021) đã gây bệnh cho Dendrobium sp. (Sonia Earsakul), do đó đáp ứng các định đề của Koch.

3. Tổng hợp quy mô lớn các nano kẽm oxit từ vỏ chuối có hoạt tính kháng nấm chống lại Colletotrichum sp. (KUFC 021) Trong ống nghiệm

Để nghiên cứu hoạt tính chống nấm của các nano kẽm oxit chống lại nấm Colletotrichum sp. (KUFC 021), tác động ức chế của các nồng độ khác nhau của các NP ZnO phân tán trong nước khử ion đối với sự phát triển của nấm được phân tích ở các thời điểm khác nhau. Từ Hình 3 , sự phát triển xuyên tâm của nấm Colletotrichum sp. (KUFC 021) đã bị phá hủy đáng kể bởi 1.000 mg / mL (liều khuyến cáo của nhà sản xuất) thuốc diệt nấm toàn thân thương mại và carbendazim trong mọi thời điểm. Ngược lại, 1.000 mg / mL của cả mancozeb (thuốc diệt nấm tiếp xúc thương mại) và các NP ZnO tổng hợp không thể ức chế sự phát triển của nấm tại bất kỳ thời điểm nào. Tuy nhiên, 4.000 mg / mL ZnO NPs ức chế vừa phải sự phát triển của Colletotrichumsp. (KUFC 021) vào ngày thứ 7 và hiệu ứng giảm nhẹ vào ngày thứ 10 và ngày thứ 14.

Hình 3: Tác dụng ức chế của các nano kẽm oxit tổng hợp chống lại sự phát triển của nấm Colletotrichum sp. (KUFC 021) trên tấm PDA.

Tiếp theo, thử nghiệm hoạt tính kháng nấm tiếp tục được tiến hành bằng cách sử dụng nồng độ ZnO NP cao hơn để xác định khả năng kiểm soát hiệu quả đến mức ức chế sinh trưởng 50% (EC ₅₀ ) chống lại sự phát triển của Colletotrichum sp. phân lập KUFC 021. Kết quả là, hoạt tính kháng nấm của các NP ZnO tổng hợp được thể hiện một cách phụ thuộc vào liều lượng. Hiệu quả ức chế tốt nhất được quan sát vào ngày thứ 7 với giá trị EC ₅₀ bằng 13.991,6 mg / mL (Hình 4 ). Sau đó, hiệu ứng của chúng được phát hiện là giảm nhẹ vào ngày thứ 9 (EC₅₀=14215.4 mg/ml). Mặt khác, sự ức chế ít nhất được thể hiện vào ngày thứ 3 (EC₅₀ =17717.5 mg/ml). Do đó, kết quả cho thấy nồng độ và thời gian tối ưu để xử lý các NP ZnO chống lại Colletotrichum sp. (KUFC 021).

Hình 4:Hoạt tính kháng nấm của các nồng độ khác nhau của các nano kẽm oxit tổng hợp chống lại sự phát triển của nấm Colletotrichum sp. (KUFC 021). (a) Hiệu ứng ức chế trên tấm PDA tại các thời điểm khác nhau. (b) Phân tích định lượng và giá trị EC ₅₀ của các NP ZnO tổng hợp.

4. Ảnh hưởng của các nano kẽm oxit tổng hợp từ vỏ chuối đến sự phát triển của nấm Colletotrichum sp. (KUFC 021) Trong Vivo

Tiếp theo, hoạt tính kháng nấm của các NP ZnO tổng hợp được đánh giá in vivo . Từ Hình 5 , các triệu chứng điển hình của bệnh thán thư đã phát triển rõ ràng trên các lá của đối chứng dương tính (+ đối chứng) đã được cấy vi khuẩn Colletotrichum sp. (KUFC 021) tạm ngừng cả hai thời điểm. Mặt khác, các cây đối chứng âm tính (-control) không nhiễm nấm vẫn có lá khỏe mạnh. Trong điều kiện nhà kính, các cây phong lan được xử lý bằng các NP tổng hợp ZnO cho thấy ít triệu chứng bệnh hơn trên lá giống như carbendazim và mancozeb.

Hình 5: Đánh giá hoạt tính chống nấm của các NP ZnO tổng hợp trên lá cây lan được cấy nấm Colletotrichum sp. (KUFC 021) trong điều kiện nhà kính.

Tính toán mức độ bệnh và phần trăm chỉ số mức độ nghiêm trọng của bệnh xác nhận rằng việc xử lý 30 g/L của các nano kẽm oxit tổng hợp có thể so sánh với liều khuyến cáo của nhà sản xuất đối với carbendazim (1 g / L) vào ngày thứ 7 và tốt hơn đáng kể vào ngày 14 (Bảng 1 ). Hơn nữa, ảnh hưởng của các nano kẽm oxit tổng hợp cũng tương đương với 1,5 g / L mancozeb (Bảng 1 ).

Bảng 1: Ảnh hưởng của các nano kẽm oxit tổng hợp chống lại Colletotrichum sp. (KUFC 021) trong nhà kính. Các chữ cái thường thể hiện sự khác biệt đáng kể được xác định bởi ANOVA, tiếp theo là bài kiểm tra posthoc của Duncan.

Thảo luận

Các điều kiện tổng hợp của các NP ZnO đã được báo cáo là có ảnh hưởng đáng kể đến kích thước và hình dạng của các hạt do đó ảnh hưởng đến các đặc tính vật lý và sinh học của chúng. Các yếu tố quan trọng bao gồm loại [ 41 ] và nồng độ của tiền chất [ 19 ], nhiệt độ [ 42 ], và quy trình [ 12 ]. Đối với quá trình, các thực thể sinh học và nồng độ của chúng [ 43 ] cũng là những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hình thái của các NP ZnO. Trước đây, chúng tôi đã tổng hợp các NP ZnO từ dịch chiết vỏ chuối và thu được năng suất trung bình ở quy mô phòng thí nghiệm (0,5-1,0 g) [ 19]. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã đơn giản hóa quy trình tổng hợp bằng cách sử dụng giấy lọc thay vì ly tâm và tăng thể tích của cả bộ gõ và dịch chiết vỏ chuối. Ở đây, chúng tôi đã thu được năng suất của các NP ZnO tăng khoảng 170 lần mà không có sự xuất hiện của các tạp chất tinh thể khác. Vì nghiên cứu này có thể tạo ra trung bình 177 g cho mỗi phản ứng tổng hợp, điều kiện tổng hợp này là khả thi để cung cấp liều lượng hiệu quả để kiểm soát bệnh trong nhà kính. Với việc kiểm tra kiểm soát chất lượng về hình dạng và kích thước của các hạt ZnO, chi phí sản xuất vào khoảng $ 0,55 USD. Giá này có thể so sánh với giá của các NP ZnO thương mại trên thị trường. Hơn thế nữa,44 , 45 ]. Mặc dù kết quả FTIR cũng xác nhận các nhóm chức năng của chất phytochemical có trong dịch chiết vỏ chuối như đã báo cáo trước đây [ 19 ], một quy trình sửa đổi cho quá trình tổng hợp này dẫn đến hình thái mới của các NP ZnO với hình dạng tròn 256 ± 40 nm..

Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng các hạt ZnO có hoạt tính kháng khuẩn mạnh trong khi một số nghiên cứu đã đề cập đến tác dụng chống nấm của chúng. Nghiên cứu này lần đầu tiên đánh giá hoạt tính kháng nấm của các NP ZnO từ chiết xuất vỏ chuối chống lại Colletotrichum sp. Các NP ZnO tổng hợp của chúng tôi đã ức chế đáng kể sự phát triển của nấm Colletotrichum sp. (KUFC 021) và giảm mạnh các triệu chứng bệnh thán thư. Mặc dù tác dụng ức chế của chúng yếu hơn so với carbendazim và mancozeb, nhưng tác dụng ức chế kéo dài của các NP ZnO tổng hợp chống lại Colletotrichumsp. (KUFC 021) đã được quan sát trong nhà kính, và nó có xu hướng tốt hơn cả mancozeb và carbendazim. Ngoài ra, độc tính của cả carbendazim và mancozeb đã làm tăng mối quan tâm nghiêm trọng về an toàn. Ví dụ, carbendazim đã được báo cáo là gây ra độc tính trên tinh hoàn và tinh trùng chưa trưởng thành ở chuột đực [ 46 ] và thậm chí liều thấp của nó (10 mM hoặc 1,91 g / L) có thể ảnh hưởng đáng kể đến gan và huyết học của mô hình chuột [ 47 ]. Tương tự, mancozeb đã được chứng minh là gây ra stress oxy hóa trong các dòng tế bào động vật có vú, bệnh tuyến giáp [ 48 ], tác dụng độc thần kinh cấp tính và rối loạn chức năng ty thể ở động vật thí nghiệm trưởng thành [ 49]. Đáng chú ý, carbendazim và mancozeb là những loại thuốc diệt nấm được sử dụng nhiều để kiểm soát bệnh nấm trên hoa lan [ 50 ]. Do đó, việc phát triển thuốc diệt nấm thay thế an toàn là rất quan trọng. De la Rosa-García và cộng sự. (2018) cho thấy rằng các NP ZnO được tổng hợp hóa học (kích thước ~ 26-37 nm) bằng phương pháp đồng kết tủa và thủy nhiệt đã ức chế đáng kể sự phát triển của C. gloeosporioides cô lập từ quả bơ với nồng độ ức chế tối thiểu bằng 0,312 mg / mL trên đĩa PDA [ 51 ]. Hơn nữa, Pariona et al. (2020) báo cáo rằng 1 mg / mL NPN ZnO tổng hợp hóa học có hình dạng tiểu cầu (kích thước 256 ± 40 nm) bằng cách sử dụng phương pháp thủy nhiệt đã ngăn chặn sự phát triển của C. gloeosporioides trên các tấm PDA bằng sự ức chế 60%, mạnh hơn so với các NP ZnO có dạng que (kích thước 780×142 nm) và hình cầu (kích thước 18 ± 2 nm) các hình [ 52 ].

Ngoài ra, việc sử dụng ZnO NP trên lá đã được báo cáo để tăng cường sự phát triển của cây trồng, năng suất quả và tích lũy sinh khối ở các loại cây khác nhau như cây hồ tiêu habanero [ 53 ], ngô [ 54 ], lúa mì [ 55 ], và kê đuôi chồn [ 56 ] . Tuy nhiên, tùy thuộc vào kích thước thực vật, loại thực vật, nồng độ NP, thời gian tiếp xúc và loài thực vật, các NP có thể tạo ra độc tính thực vật, độc tế bào, độc tính gen, hoặc stress oxy hóa ở thực vật [ 57 , 58 ]. Mặc dù các cây phong lan được xử lý bằng nano kẽm oxit có vẻ khỏe mạnh trong suốt quá trình thử nghiệm của chúng tôi, nhưng vẫn cần một cuộc điều tra lâu dài để xác định tác động của các NPN ZnO đối với sự phát triển của cây phong lan.

Tổng hợp lại, hình thái thích hợp của các NP ZnO có thể đóng vai trò như một chất chống nấm mới. Chúng tôi biết rằng NPN tổng hợp ZnO của chúng tôi cần liều lượng cao để ngăn chặn sự phát triển của nấm Colletotrichum sp. Chúng tôi hiện đang thực hiện các thí nghiệm bằng cách sử dụng các vật liệu sinh học khác nhau để tổng hợp với sự kết hợp của pha tạp kim loại để cải thiện các đặc tính vật lý và sinh học của các NP ZnO tổng hợp.

Kết luận

Nghiên cứu này nêu bật quy mô tổng hợp lớn các nano kẽm oxit từ chiết xuất vỏ chuối bằng phương pháp tổng hợp xanh. Các nano kẽm oxit tổng hợp có hình dạng tròn, kích thước 256 ± 40 nm, thu được không có tạp chất tinh thể khác và có khoảng trống vùng năng lượng trung bình ~ 2,8 eV. Liều cao của các NP ZnO được tổng hợp đã ngăn chặn đáng kể sự phát triển của nấm Colletotrichum sp cô lập. (KUFC 021) từ cây phong lan trên đĩa nuôi cấy. Hơn nữa, họ làm giảm đáng kể các triệu chứng bệnh thán thư trên lá được cấy nấm Colletotrichum sp. (KUFC 021) trong điều kiện nhà kính.

Nguồn tham khảo: Large Scale Synthesis of Green Synthesized Zinc Oxide Nanoparticles from Banana Peel Extracts and Their Inhibitory Effects against Colletotrichum sp., Isolate KUFC 021, Causal Agent of Anthracnose on Dendrobium Orchid Nattanan Panjaworayan T-Thienprasert,¹ Jiraroj T-Thienprasert,^2,3 Jittiporn Ruangtong,¹ Thitiradsadakorn Jaithon,¹ Pattana Srifah Huehne,⁴ and Onuma Piasai